血管性癡呆(VD)動(dòng)物模型

一、 雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷模型(Model of occlusion of bilaterial carotis communis artery)

(1)復(fù)制方法  雄性大鼠，體重為250～300g。以水合氯醛(按350～400mg/kg體重的劑量)經(jīng)腹腔注射麻醉后仰臥位，剃除頸部毛發(fā)，手術(shù)區(qū)域皮膚消毒。頸部正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用1號(hào)線將其行結(jié)扎。縫合切口后再行局部消毒，小心放回籠內(nèi)(每籠一只待其*清醒)。局部傷口縫合前，可用慶大霉素3～5滴滴入局部傷口內(nèi)防止感染。術(shù)后正常飼養(yǎng)12周，自第13周起可開始分組給藥治療。行為學(xué)檢驗(yàn)可采用穿梭箱法和Morris水迷宮分析系統(tǒng)，進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)。

(2)模型特點(diǎn)  術(shù)后的1～3周，陸續(xù)有動(dòng)物死亡發(fā)生，其死亡率在20％～40％，因此需根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加手術(shù)動(dòng)物的總數(shù)。

(3)比較醫(yī)學(xué)  該模型由于阻斷了雙側(cè)頸總動(dòng)脈，造成了腦部急性供血不足，隨后可通過基底動(dòng)脈和基底動(dòng)脈環(huán)血流調(diào)節(jié)以及逐漸形成的側(cè)支循環(huán)所改善，但海馬區(qū)達(dá)不到正常腦供血水平，形成慢性大腦缺血，模擬了人類由于血管粥樣硬化使頭頸動(dòng)脈逐漸狹窄所致的慢性大腦供血不。水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，動(dòng)物的定位航行和空間探索能力均降低，癡呆率達(dá)80％左右。該模型可用于研究癡呆腦組織的形態(tài)及病理生理變化機(jī)制，也可用于判定某些治療手段和藥物的效果。

二、 雙側(cè)頸總動(dòng)脈、椎動(dòng)脈阻斷模型(Model of occlusion of bilaterial carotis communis artery with vertebral artery)

(1)復(fù)制方法  雄性大鼠，體重為300～350g。以水合氯醛(按350～400mg/kg體重的劑量)經(jīng)腹腔注射麻醉后俯臥位固定于立體定位儀上，剃除頸部毛發(fā)，手術(shù)區(qū)域皮膚消毒。行背側(cè)頸部正中切口，逐層鈍性分離暴露雙側(cè)第1頸椎橫突小孔，用直徑0.5mm的電凝針燒灼雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，造成閉塞。再將大鼠仰臥位固定，行腹側(cè)頸正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，以4號(hào)線穿線備用。24h后麻醉，用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈5min，間隔1h后再夾閉5min，共夾閉3次。術(shù)后連續(xù)5d經(jīng)肌肉注射慶大霉素，每只2萬U/d。

(2)模型特點(diǎn)  雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉后1min，大鼠翻正反射消失，意識(shí)喪失，再通1h后意識(shí)逐漸恢復(fù)，翻正反射出現(xiàn)。動(dòng)物造模2周后其主動(dòng)回避反應(yīng)明顯下降，海馬腦片上 LTP降低，細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變明顯。行為學(xué)檢查可采用穿梭箱法和Morris水迷宮法。術(shù)后也有動(dòng)物死亡發(fā)生，因此要根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加手術(shù)動(dòng)物的總數(shù)，若出現(xiàn)肢體運(yùn)動(dòng)障礙的大鼠應(yīng)予以剔除。

(3)比較醫(yī)學(xué)  反復(fù)缺血再灌注和長(zhǎng)期慢性低灌流是血管性癡呆的重要原因。該模型通過燒灼閉塞了雙側(cè)椎動(dòng)脈，造成長(zhǎng)期慢性腦灌注不足；反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成動(dòng)物腦組織的反復(fù)缺血再灌注，與臨床VD的發(fā)病類似。此模型是目前*的VD造模方法。它較好地模擬了VD的發(fā)病特點(diǎn)，且缺血后生理指標(biāo)較穩(wěn)定，病理改變較為充分明確，卒中指數(shù)低，無明顯肢體運(yùn)動(dòng)障礙。

三、 多發(fā)性腦梗死性癡呆(DMI)動(dòng)物模型(Model of dementia of multi-infarction in brain)

(1)復(fù)制方法  SD大鼠，雌雄不拘，體重為350～450g(10月齡以上)的老齡鼠。

1)模型制備  用以水合氯醛(按350～400mg/kg體重的劑量)經(jīng)腹腔注射麻醉，剃除頸部毛發(fā)，手術(shù)區(qū)域皮膚消毒。頸正中切開皮膚，分離肌肉，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、外動(dòng)脈。用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈，從頸外動(dòng)脈處逆行穿刺插管注入0.2～0.4ml栓塞液(取SD大鼠無菌自然干燥的血凝塊，研碎分級(jí)過篩，選直徑100～200目的微粒溶于生理鹽水中，制成200g/L的懸濁液，即栓塞液)，結(jié)扎頸外動(dòng)脈。然后開放頸總動(dòng)脈夾，使栓子通過頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)至大腦各動(dòng)脈，造成多灶性腦梗死。局部傷口縫合前，術(shù)后連續(xù)5d肌肉注射慶大霉素，每只2萬U/d。雙側(cè)多發(fā)性梗死性癡模型制作時(shí)，兩側(cè)頸外動(dòng)脈同時(shí)注入栓塞液，方法劑量同上。

2)檢測(cè)指標(biāo)

①行為學(xué)癥狀  術(shù)后24h觀察動(dòng)物的活動(dòng)并進(jìn)行神經(jīng)分級(jí)。0級(jí)：動(dòng)物肢體活動(dòng)無明顯障礙；1級(jí)：提起鼠尾頭垂向患側(cè)，前肢下垂；2級(jí)：動(dòng)物行走出現(xiàn)追尾現(xiàn)象；3級(jí)：動(dòng)物行走障礙。

②學(xué)習(xí)記憶障礙測(cè)試  采用穿梭箱法和Morris水迷宮法對(duì)動(dòng)物的記憶功能進(jìn)行檢測(cè)。

③病理標(biāo)本制作  分別于第10日、20日測(cè)定后處死動(dòng)物。一半動(dòng)物取腦標(biāo)本做成腦切片，用三苯四唑(TTC)染色，觀察梗塞面積及病理變化。另一半動(dòng)物取腦標(biāo)本固定于10％甲醛液內(nèi)，作3個(gè)冠狀切面，同時(shí)取小腦、中腦、橋腦、延髓制成切片，HE染色光學(xué)顯微鏡下檢查。

(2)模型特點(diǎn)  單側(cè)栓塞動(dòng)物手術(shù)后的死亡率在20％～25％，雙側(cè)栓塞動(dòng)物術(shù)后的死亡率高達(dá)40％～50％。動(dòng)物麻醉清醒后能站立，但大多數(shù)有不同程度的跛行(尤以后肢明顯)；病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，注入的微球大部分集中在手術(shù)同側(cè)腦半球，少數(shù)在異側(cè)，梗死區(qū)多分布在同側(cè)大腦中動(dòng)脈和前動(dòng)脈區(qū)，少數(shù)分布在異側(cè)前動(dòng)脈區(qū)。TTC染色見，正常腦組織呈深橙紅色，腦缺血區(qū)不著色或著色淺。單側(cè)多發(fā)性腦梗死鼠腦內(nèi)病灶為3～5個(gè)。雙側(cè)腦栓塞腦內(nèi)病灶可達(dá)6～8個(gè)；顯微鏡檢查可見，栓死區(qū)軟腦膜及腦血管充血擴(kuò)張，血管周圍間隙增寬，腦內(nèi)紅細(xì)胞堆積，神經(jīng)細(xì)胞呈局部缺血性改變，胞體不同程度的縮小，核固縮呈三角形或桿狀。梗死灶中常見單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞增生和纖維蛋白聚集。海馬區(qū)AChE陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。

(3)比較醫(yī)學(xué)  與大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血、雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎致前腦缺血、四血管閉塞致全腦缺血等模型相比， DMI模型較好地模擬了臨床DMI的行為癥狀和病理形態(tài)學(xué)改變，更接近于人類自然栓塞現(xiàn)象。且已被證實(shí)該法造模與人類VD的病理基本相似。DMI模型大鼠可出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，造模成功率高，手術(shù)創(chuàng)傷小，是迄今為止用來評(píng)價(jià)抗VD藥物作用及探討藥物作用機(jī)制較為常用的動(dòng)物模型。DMI模型亦存在著諸多不①DMI模型大鼠存活時(shí)間較短，長(zhǎng)也未能超過30d，與臨床病程相差甚遠(yuǎn)。②翼突腭動(dòng)脈是頸內(nèi)動(dòng)脈的分支，故在造模過程中，栓子進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈的同時(shí)，也會(huì)流入翼突腭動(dòng)脈，導(dǎo)致顱外梗塞。③術(shù)后結(jié)扎了頸外動(dòng)脈，阻斷了部分腦血供。④頸外動(dòng)脈較細(xì)，壓力高，注入栓子困難，進(jìn)針時(shí)易刺穿甚至挑斷血管，造成血液外流。盡管如此，截至目前，DMI動(dòng)物模型仍不失為一個(gè)常用的較好VD模型。

四、 小鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型(Ischemia and reperfusion in mice)

(1)復(fù)制方法  雌性、雄性小鼠皆可，體重為25～30g。術(shù)*h禁食不禁水。小鼠經(jīng)腹腔注射烏拉坦(按1.0g/kg體重的劑量使其麻醉，待翻正反射消失后，仰位固定。頸部皮膚消毒，行正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，38℃下行10min夾閉、20min再通，如此反復(fù)3次，并使動(dòng)物失血5％～10％的血容量。術(shù)中注意頸部創(chuàng)面點(diǎn)滴2～3滴(2.50×10000U/kg體重)慶大霉素。術(shù)后24h、48h進(jìn)行學(xué)習(xí)、記憶的行為學(xué)檢測(cè)。手術(shù)期間注意給動(dòng)物保溫。

(2)模型特點(diǎn)與比較醫(yī)學(xué)  術(shù)后3～30d神經(jīng)病理學(xué)與行為學(xué)動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，模型小鼠的大腦皮質(zhì)變薄，額葉皮質(zhì)錐體細(xì)胞核固縮，局限性神經(jīng)元數(shù)目減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生，形成多處結(jié)節(jié)。海馬CA1區(qū)細(xì)胞缺失和排列不規(guī)則，且隨時(shí)間推移逐漸加重，至術(shù)后30d，海馬CA1區(qū)細(xì)胞幾乎*脫失，膠質(zhì)細(xì)胞大量增生，CA2、CA3區(qū)細(xì)胞也嚴(yán)重脫失，呈現(xiàn)海馬硬化。與此同時(shí)模型小鼠表現(xiàn)出顯著的缺血性學(xué)習(xí)記憶障礙。該模型的優(yōu)勢(shì)在于其方法簡(jiǎn)便可靠，且小鼠價(jià)廉，適合于藥物的初篩。