1 白細胞減少癥動物模型(Animal model of leucopenia)

在研究化療藥物毒性的減毒實驗中，經(jīng)常需要建立化療所致的白細胞減少癥及骨髓有核細胞減少癥的動物模型。白細胞減少癥(leucopenia)為臨床常見血液病。凡機體外周血液中白細胞數(shù)持續(xù)低于4×1000000000/L時，稱之為白細胞減少癥；若機體白細胞總數(shù)明顯減少，低于2×1000000000/L，中性粒細胞值低于0.5×1000000000/L甚至消失者，則稱為粒細胞缺乏癥(agranulocysis)。臨床上白細胞減少癥患者的臨床表現(xiàn)主要為乏力、頭暈，并常伴有食欲減退、四肢酸軟、失眠多夢、低熱心悸、畏寒腰酸等癥狀；而粒細胞缺乏癥則多以突然發(fā)病、畏寒高熱、咽痛為主。粒細胞缺乏癥為白細胞減少癥發(fā)展至嚴重階段的表現(xiàn)，兩者病因和發(fā)病機制基本相同。臨床上白細胞減少癥主要可分為原因不明性和繼發(fā)性兩種。其中又以前者多見，而后者則多為化學因素、物理因素、藥物因素及某些疾?。换蚩梢娪诟鞣N實體腫瘤化療后、多種血液疾病、嚴重感染及原因不明者等。

1.1 大鼠白細胞減少癥模型

(1)復(fù)制方法  體重約為150g的SD大鼠，按30mg/kg體重的劑量經(jīng)其腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)注射5d。模型大鼠在給藥前、給藥第3, 5日，以及停藥后第2, 5, 8, 11, 15日時分別采血作外周血象檢測，觀察外周血白細胞總數(shù)。后1次檢測觀察后麻醉處死動物，取其股骨，用hanks液沖洗骨髓細胞，顯微鏡下觀察骨髓有核細胞數(shù)。

(2)模型特點  注射環(huán)磷酰胺后，模型大鼠的食耗量、飲水量減少，活動減少，被毛疏松無光澤，體重增長趨緩，明顯消瘦；停藥15d后機體開始明顯恢復(fù)。給藥3d時，模型大鼠的外周血白細胞總數(shù)明顯降低，給藥5d時其外周血白細胞總數(shù)可降至低值；停藥后第2日時白細胞總數(shù)無明顯回升，停藥第5, 8, 11, 15日時，白細胞總數(shù)呈逐漸回升趨勢；模型大鼠低白細胞水平維持時間較長，至停藥后第15日時仍未見明顯回升。鏡下觀察顯示：模型大鼠的骨髓有核細胞數(shù)較正常動物明顯降低。

(3)比較醫(yī)學  本模型通過對動物機體白細胞總數(shù)、體重變化以及骨髓有核細胞數(shù)檢測結(jié)果的多點動態(tài)分析，模型大鼠表現(xiàn)出低白細胞、低骨髓有核細胞及低體重的特點，與臨床上腫瘤患者的化療毒性一致，本模型可用于臨床化療毒性的防治、藥物篩選或其他防治方法方面的研究。以往這方面的研究均用小鼠建立模型，但由于小鼠外周血白細胞第6日以后即可超越基礎(chǔ)水平，往往造成實驗觀察時間不夠，導(dǎo)致無法評價實驗結(jié)果。而本方法建立的模型，停藥后模型大鼠白細胞回升緩慢，至停藥后第15日時仍能維持低白細胞水平狀態(tài)，因此能夠滿足實驗研究的觀察時間。

1.2 急性白血病動物模型(Animal model of acute myelogenous leukemia)

臨床上急性白血病(acute myelogenous leukemia, AML)是指機體內(nèi)一種或多種造血干細胞及祖細胞惡變，失去正常的增殖、分化及成熟能力，無控制的持續(xù)增殖，逐步取代骨髓并經(jīng)丨血液浸潤至全身組織及器官。

1.小鼠粒單白血病模型

(1)復(fù)制方法  體重約為20g，年齡為8周齡的 BALB/c雄性小鼠。用1000r/min離心急性粒單白血病細胞的培養(yǎng)液10min，去上清后用生理鹽水清洗3次，調(diào)整濃度至2×1000000000/L。經(jīng)小鼠尾靜脈注射已制備好的細胞懸液，0.5ml/只。接種后每天觀測模型小鼠的生存天數(shù)，采血作小鼠外周血白細胞計數(shù)、未成熟粒單核細胞百分率及骨髓原始粒單核細胞百分率檢測，透射電鏡下觀察其骨髓白血病細胞形態(tài)。

(2)模型特點  采用尾靜脈途徑接種的方法，模型小鼠的生存時間可達到(38.40±2.21)d；其外周血白細胞計數(shù)和未成熟粒單核細胞百分率在接種第14日時明顯升高，分別為(19.24±1.73)×1000000000/L和(6.24±0.85)％，并有逐漸上升的趨勢；其骨髓原始粒單核細胞百分率亦明顯升高，可達到(41.3±4.90)％。本模型制作方法簡便，容易掌握，模型成功率高，重復(fù)性好。實驗過程中，模型小鼠由于免疫力低下，因此需加強對動物實驗及飼養(yǎng)管理條件的控制。

(3)比較醫(yī)學  臨床上急性粒單白血病以骨髓或外周血中同時出現(xiàn)原始髓系細胞分化而來的原幼粒系和單核系兩種幼稚細胞為主要特征。本模型的病理特點與臨床人類急性粒單白血病相似，適用于臨床同類疾病發(fā)病機理及藥物治療方面的研究。

1.3 慢性白血病動物模型(Animal model of chronic myelogenous leukemia)

臨床上慢性白血病(chronic myelogenous leukemia,  CML)可分為慢性骨髓細胞性白血病和慢性淋巴細胞白血病兩種。慢性骨髓細胞性白血病，簡稱慢粒(chronic myelognous leukemia, CML)，是臨床上一種起病及發(fā)展相對緩慢的白血病。它是一種起源于骨髓多能造血干細胞的惡性增殖性疾病，表現(xiàn)為髓系祖細胞池擴展，髓細胞系及其祖細胞過度生長。CML臨床上以乏力、消瘦、發(fā)熱、脾腫大及白細胞異常增高為主要表現(xiàn)。慢性淋巴細胞白血病，簡稱慢淋(Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL)，是機體的淋巴細胞在體內(nèi)異常增生和積蓄伴有免疫功能低下的疾病。由于慢淋患者淋巴細胞壽命極長，并經(jīng)常伴有免疫反應(yīng)缺陷，故又稱免疫無能淋巴細胞蓄積病。臨床主要表現(xiàn)是以淋巴結(jié)腫大為主，常伴有肝脾腫大，貧血及出血等癥狀，少數(shù)患者還伴有皮膚損害。

1.免疫缺陷小鼠－人慢性粒白血病模型

(1)復(fù)制方法  NOD/D小鼠，系通過D小鼠與 NOD/Lt品系(TL、BL、NK細胞缺陷，循環(huán)補體缺乏，抗原呈遞細胞分化及功能不良)回交得到的NOD/Ltsz-scid/scid小鼠(簡稱NOD-D小鼠)。先用400cGy 60Coγ射線照射小鼠，再從未接受過化療的慢性期CML患者的新鮮骨髓和外周血中分離出白血病細胞，將(8～14)×10000000白血病細胞從尾靜脈輸入已經(jīng)過亞致死量射線照射的小鼠，并交替腹腔注射PIXY321(7μg)及c-kit配體(10μg)制劑。CML細胞移植后30～90d內(nèi)處死小鼠，用人bcr特異DNA探針進行 Southern印跡分析和流式細胞儀檢測。

(2)模型特點  移植后的NOD/D小鼠體內(nèi)大約70％的人CML細胞為Ph-細胞。無論是用CML患者的骨髓細胞還是外周血細胞移植，ph+細胞檢測水平很相似。用本方法復(fù)制CML模型，NOD/D小鼠效果要優(yōu)于D小鼠。由于NOD/D小鼠體內(nèi)缺乏功能性NK細胞，采用較少數(shù)量的患者CML慢性期細胞就能成功建立模型。如將人造血干細胞或胎肝細胞移植到NOD/D小鼠體內(nèi)，則人髓系白細胞數(shù)明顯增加，人造血干細胞明顯向髓系方向分化，而紅系細胞和淋巴系細胞明顯減少；此時如采用患者 CML細胞，尤其是加速期和急變期細胞更容易移植成功。

(3)比較醫(yī)學  以往研究發(fā)現(xiàn)來源于CML患者急變期的瘤細胞能夠在SCD小鼠身上繁殖，白血病細胞在轉(zhuǎn)移到無造血功能組織之前主要分布在骨髓、外周血，與其在人體內(nèi)的分布極其相似。但由于小鼠的造血生長因子、黏附分子和細胞外基質(zhì)與人并不相同，因此建立的免疫缺陷小鼠-人慢粒白血病模型仍存在局限性。但是采用NOD/ SCD小鼠仍可用于制備較為理想的人CML動物模型。

2.用表達P210逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠骨髓細胞并移植正常鼠

(1)復(fù)制方法  分離用氟尿嘧啶(5-Fu)(150mg/kg體重)預(yù)處理的雄性BALB/c小鼠骨髓細胞，并以P210基因逆病毒載體轉(zhuǎn)染，按(1～2)×100000細胞注射到接受致死劑量照射的同源雌性小鼠體內(nèi)。潛伏期大于20周的小鼠表現(xiàn)出粒細胞異常增生，造血功能紊亂，從這些小鼠身上分離的細胞，可有效地移植到經(jīng)照射的同源小鼠體內(nèi)，表明轉(zhuǎn)染bcr/abl基因的鼠骨髓細胞具有高度再生能力，可用來模擬人CML。采用MSC逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，可提高表達ber/abl融合基因的病毒滴度，CML潛伏期短，接受轉(zhuǎn)染細胞的小鼠經(jīng)過4～6周潛伏期后都可發(fā)生CML。主要變化有外周血白細胞顯著增多，脾臟腫大，bcr/abl融合蛋白大量表達。

(2)模型特點  發(fā)現(xiàn)無論abl基因的形式如何，均有90％小鼠發(fā)生腫瘤。在這些小鼠中有大約50％小鼠表現(xiàn)異常骨髓增殖，與人慢性粒細胞白血病慢性期的特征有許多相似之處，而其余的小鼠則表現(xiàn)為B淋巴細胞異常增生。

(3)比較醫(yī)學  采用本方法建立的CML動物模型與臨床上人類CML尚有一些差異，如大多數(shù)CML模型鼠往往在短期內(nèi)迅速死亡，沒有經(jīng)歷類似于人CML的慢性期，而且模型動物肺部出血現(xiàn)象很明顯，這在人類CML很少見。

3.bcr/abl轉(zhuǎn)基因小鼠模型

(1)復(fù)制方法  用小鼠的Tec基因的啟動子序列(-1948至+22)作為調(diào)節(jié)序列，制備轉(zhuǎn)基因載體。Tec基因的啟動子序列調(diào)控P210蛋白的表達，制備轉(zhuǎn)基因小鼠， bcr/abl融合蛋白的表達對小鼠的胚胎有致死性。

(2)模型特點  目前仍不能獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠及其子代均表現(xiàn)CML癥狀，一些個體可能表現(xiàn)出急性白血病癥狀。

(3)比較醫(yī)學  多數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠先出現(xiàn)粒細胞異常增生、高血小板血癥，經(jīng)時間后發(fā)生骨髓增殖綜合征(MPD)，和人CML極為相似。少數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后即表現(xiàn)為急性白血病，但它們的子代經(jīng)過一段潛伏期后表現(xiàn)為骨髓增生綜合征。表明選擇恰當?shù)膯幼訉?gòu)建CML轉(zhuǎn)基因鼠是十分重要的。